抗酸染色实验报告分析讨论,抗酸染色实验报告分析讨论发言

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本文刊载于《临床实验室》杂志2022年10月刊专题“临床微生物检验”-「专论」版块

作者：艾效曼 吴文娟 胡云建 胡继红

单位：北京医院检验科（艾效曼 胡云建）；同济大学附属东方医院南院检验科（吴文娟）；北京医院 国家卫生健康委临床检验中心（胡继红）

检验前


1.血培养采集指征：

（1）基本指征：包括发热伴中性粒细胞减少、不明原因发热、疑似血管内感染如导管相关性感染、疑似感染性心内膜炎及疑似脓毒血症。基本的体征标准如发热（体温＞38℃）或局部中重度感染。在考虑不同临床目的血培养采集指征时，应关注不同人群包括不同基础性疾病、年龄、流行病学及侵袭性操作等情况进行总结和说明。

（2）无需做常规血培养的情况：来自社区患有哮喘或毛细支气管炎的儿童；没有共存病、无并发症的皮肤和软组织感染的儿童和成人患者；免疫力正常社区患者的轻度发热、术后1 h内的发热、孤立的发热、原因明确的非感染性发热、长期护理机构大多数居住者的轻度临床表现。

2.血培养的采集：

（1）血培养瓶种类及选择：根据临床初步诊断选择需氧菌、厌氧菌、分枝杆菌和真菌专用培养瓶进行检测。添加了溶血素的培养瓶有助于胞内菌生长。裂解离心系统能有利于双相真菌和丝状真菌的培养和分离。

对于疑似血流感染患者应同时进行厌氧菌和需氧菌培养，对于疑似导管相关血流感染建议同时抽取导管血及外周血培养。

（2）儿童瓶的使用：由于专性厌氧菌引起的菌血症在儿科患者中很少见，建议仅使用需氧瓶。高危人群可考虑使用厌氧瓶，包括母亲在分娩期间延迟破膜或产妇患有绒毛膜羊膜炎的新生儿，患有慢性口腔或鼻窦感染、蜂窝组织炎、腹部感染、咬伤或感染性静脉炎体征和症状的儿科患者，以及正在接受类固醇治疗的中性粒细胞减少症的儿科患者。最近的研究表明，在某些儿童群体中，兼性厌氧菌能较早或仅在厌氧血培养瓶中被检测到，该情况下建议使用厌氧培养瓶。对疑似或确诊早期新生儿脓毒症的患者建议进行脐带血的血培养。在应用抗菌药物前进行血培养采集，对于已接受抗菌药物治疗的患者，建议使用含吸附剂或中和剂的培养瓶，树脂吸附性能优于活性碳。

（3）血培养标本采集时间和间隔：初次以临床诊断为目的的成人及儿童血培养采用24小时内2～3套，如果新生儿体重和总血容量不允许的情况下，可采集1瓶儿童需氧瓶，并且建议根据临床需要同时进行脑脊液或尿液培养。

初次采集血培养后，通常2～5天内不必重复采血。在患者处于发热峰值时采集标本对血培养阳性率无显著影响。感染性心内膜炎采血首次培养采集3套，若24小时培养结果为阴性，应再追加2套，共采集5套血培养。如果最初的培养均为阴性，则应该考虑诊断方向。

3.血培养标本采集方法：持针器的使用更有利于安全采血。对采集部位的消毒多推荐1步法及3步法。若血量充足，注射器采集的血液勿换针头先注入厌氧瓶，蝶形针采集的血液先注入需氧瓶；若血量不足，则先注入需氧瓶。

4.血培养瓶的保存和运送：建议血培养瓶在采集后2h内送至实验室进行培养，室温运送；如延迟运送则室温保存，切勿冷藏或冷冻。不能提供24h接受服务的实验室设立与微生物室联网的血培养系统即“卫星血培养”（如急诊化验室），同时应遵循一定的生物安全管理要求。


检验中


1．自动血培养系统：使用自动血培养系统是标准化的血培养方法，可实时动态监测，相比较手工血培养，可提高效率，并最大限度地减少盲转的污染。

（1）病原体生长时间：目前的主流方法是商品化的血培养系统配合使用专用的血培养瓶进行连续监测。

（2）仪器报阳后转种：所有阳性血培养瓶(需氧和厌氧)转种哥伦比亚血平板、巧克力平板，并在35～37℃的5% CO2中孵育。阳性厌氧血培养物转种至富含维生素K 和氯化血红素厌氧血平板培养基，并在35～37℃厌氧培养，同时转种哥伦比亚血平板（耐氧试验）和巧克力平板。

（3）病原体在血培养系统中报阳时长特点：血培养分离到的多数常见菌在孵育前24～36h系统会报阳。连续监测血培养系统设置5天培养时长，能培养出大部分细菌。

在一些难培养微生物可能需要长达5天的孵育期，系统才能报阳。军团菌（Legionella）、巴尔通体（Bartonella）、支原体（Mycoplasma）、柯克西菌（Coxiella）、衣原体（Chlamydia）、 立克次体（Rickettsia ）和 Tropheryma等在传统血培养方法较难培养，可通过免疫诊断或分子技术进行鉴定。这些难培养微生物有时系统仅会给出报阳信息，但革兰染色无法辨识，甚至有限的分子生物学方法也不能鉴定出结果。这类情况也可能是非典型病原体，可采用其他染色方法（如弯曲杆菌、螺杆菌或布鲁杆菌）进行尝试。

在处理5天报阴性的血瓶时，应常规观察瓶内培养液，如培养瓶内发生溶血、产气、浑浊以及传感器颜色变化等，可能是血瓶采血8小时以后上机，也可能是特殊病原体，均可能导致假阴性。这种情况下需盲转，或增加培养时间。

2.三级报告制度:

（1）一级报告相关试验：血培养系统报阳后，实验人员记录报阳时间及生长曲线特点。一级报告相关试验通常包括以下方面。①革兰染色：在血培养系统报阳性后1小时内进行。阳性血培养属于危急值报告范畴。②革兰染色反应。③微生物形态：球菌、球杆菌、杆菌、丝状、串珠状、酵母样等 ；微生物菌体排列。④抗酸/其他染色：如遇到革兰染色不明确、不着色甚至未观察到明确菌体情况选择抗酸染色、弱抗酸染色、亚甲蓝染色、棉兰染色等。⑤初代培养基的补充：可根据染色结果补充初代培养的培养基种类。

（2）二级报告相关试验:应对24小时转种生长阴性的血培养结果进行分析。二级报告相关试验主要包括以下方面。①快速鉴定方法:根据实验室条件快速鉴定方法可应用转种后孵育适当时间的初代培养物或者直接应用培养液进行检测。对于慢生长微生物，如抗酸染色阳性细菌，实时荧光PCR方法排除结核分枝杆菌后，可对培养物进行质谱鉴定。对于疑似血流感染且高度怀疑合并严重脓毒症或脓毒性休克的高风险患者，建议在送检血培养的同时送检基于核酸检测的病原体快速鉴定。②直接药敏试验:所有血培养阳性的临床分离株均应在第一次转种时同时进行抗菌药物敏感性试验（AST）。仅对临床相关分离株进行AST，不能对污染菌进行AST。

基因型AST是表型AST的补充，在大多数情况下，革兰阳性菌耐药基因mecA、mecC和vanA/B可进行明确的药物敏感性解释；革兰阴性菌耐药基因的存在（或缺失）则不能预测治疗药物的敏感性。

（3）三级报告相关试验：最终报告应包括：最终菌种鉴定结果（菌种或亚种名）、经审核的药敏试验结果及阳性报警时间。最终报告的发放时间在报阳之后3天内。接受第三代头孢菌素治疗的患者中分离的肠杆菌属、柠檬酸杆菌属和沙雷菌属，可能被选择出表达头霉菌素酶（AmpC）的突变体，需要与临床讨论增加药敏试验的频次。

（4）危急值与三级报告：在血培养检测过程中，危急值的报告可能贯穿血培养检测全过程。血培养阳性的首次试验结果（不论染色、培养或快速鉴定）是最常报告的危急值，应当在报阳后的60mim内报告。对于每一个血培养阳性的患者，都应发布一份危急值结果报告。

后续检测过程中如发现不同于原来所传达的危急值结果，需继续与临床沟通，其他情况无需再沟通。书面报告应该清楚地表明该结果代表的是修正报告，并注明不同于以前报告的相关细节改变。其他危急值报告内容：当接收不合格的标本进行血培养检查和需要一份新的血培养（例如，血培养瓶破碎、未标记或错误标记的样本）。

无论更改的结果以危急值报告或常规报告的形式，在对以前发出的初步或最终报告结果作任何修正时，应重新发一份危急值报告。三级报告是血培养检测过程中不同时段与临床沟通时的报告形式，专家共识与CLSI-M47在各级报告的形式上略有不同（表2）。

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表2 血培养三级报告主要内容

检验后结果解读

1.血培养常见的致病菌：大肠埃希菌、肠杆菌科其他属种、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、白念珠菌等是社区和医院常见血流感染病原菌。布鲁菌、土拉热弗朗西斯菌及荚膜组织胞浆菌等为高致病菌，操作需注意生物安全防护。

2.血培养污染菌的判断及污染率评估：对于血培养结果疑似污染或定植菌，实验室常见定义是，仅在1个“系列血培养瓶”中的1瓶或套检测出以下1种或多种微生物（皮肤定植菌）：凝固酶阴性葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌、微球菌属、草绿色链球菌、棒状杆菌属、气球菌属或芽孢杆菌属，如果没有第2套血培养进行比较，几乎不能确定该分离株的临床意义。

3.污染率的计算方法：将受污染的血培养套数除以在特定时期内获得的血培养套数，再乘以100。此外，单一的血培养瓶报阳时只能判断为潜在污染，并不符合“污染”的定义，应被剔除。如果通过专业知识和临床信息资源，实验室能确认患者的单一血液培养阳性瓶分离株是污染菌，可纳入污染率统计，如培养出的菌株通常被认为是污染菌，但该患者并没有合理感染来源，但该患者并无感染症状体征，此时阳性培养瓶分离株被视为“污染” 。建议实验室建立血培养污染率计算、评价、反馈体系，以控制污染率范围，提高血培养分析前质量评价；在计算血培养污染率时分类计算，如不具备分类条件，建议采用总体计算混合污染率，血培养污染率应以＜3%为达标阈值。

4.流程优化质量管理：还应优化实验室流程，缩短检验周转时间(Turnaround time, TAT)。

5.实验室生物安全：相关操作需在生物安全柜中进行，按照“标准预防”措施进行处理。

只有将血培养检测各环节按照标准化进行操作，才能真正帮助临床诊断治疗，起到挽救病人生命的作用。


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